【研究内容】

磁性标记胎盘间充质干细胞的最佳浓度筛选

【研究机构】

宁夏医科大学临床医学院  

宁夏医科大学总医院放射科

【研究人员】

王芳  熊瑶  何花  王一帆  郭玉林

【刊发表时间及刊物】

宁夏医科大学学报，2020.02.05

【实验目的】

探讨超微超顺磁性氧化铁(USPIO)标记人胎盘间充质干细胞(hPMSCs)的最佳浓度区间，为实现其磁共振(MR)体内动态成像和临床应用提供基础研究资料。

【实验方法】

分离培养hPMSCs，以多聚赖氨酸(PLL)为转染剂，与不同浓度USPIO形成PLL-USPIO复合物，分别标记hPMSCs并考察其标记效率，检测标记后h PMSCs的存活率、增殖能力和凋亡率等生物学特性。

【实验结果与结论】

结果  普鲁士蓝染色均显示细胞质内大量铁颗粒存在，当标记浓度≥10μg·mL-1时标记率均>95%；当磁性标记浓度为15、20和25μg·mL-1时hPMSCs存活率均低于对照组(P均<0.01)； 标记浓度在25μg·mL-1内时增殖能力与对照组比较在第1天、3天、5天差异均无统计学意义(P均>0.05)，培养至第7天标记浓度为25μg·mL-1组的OD值低于对照组(P=0.047)； 各标记细胞与未标记细胞晚期凋亡率差异均无统计学意义(P均>0.05)，早期凋亡率随标记浓度增加呈递增趋势，标记浓度≥15μg·mL-1时早期凋亡率高于对照组(P<0.05)， 在标记浓度为20、25μg·mL-1总凋亡率高于对照组(P<0.05)。

结论  USPIO浓度区间为5～15μg·mL-1时可以对hPMSCs进行有效标记且对其活性、增殖能力和凋亡率等生物学特性无明显影响。

【讨论】

PMSCs是近年来新发现的从胎盘获取的一类干细胞，相比于最常用于体内外实验的骨髓间充质干细胞而言其来源丰富、采集方便。Clinical Trials数据库显示，胎盘来源干细胞可治疗白血病和其他相关血液系统疾病，还对特发性肺纤维化、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎等非血液系统疾病有效。MR示踪干细胞探讨其在活体内的作用及机制也已成为近年来的研究热点。为了克服MRI对组织信号探测的敏感性较低的缺点，最佳的方法是制备顺磁性分子探针。其中氧化铁颗粒能够产生较强的MR信号对比，目前已被成功用于肝脏损伤、良恶性肿瘤的鉴别诊断，还可为动脉粥样硬化治疗及术后转移淋巴结的评估提供丰富的信息。有研究发现对标记氧化铁颗粒的胰岛细胞追踪24周，MR信号改变仍稳定维持，因此近年来国内外学者采用氧化铁颗粒标记干细胞进行了广泛的体外和活体示踪研究。

临床上最常用的磁性纳米探针为超顺磁性氧化铁（SPIO）和USPIO，两者均可明显增加组织间的信号对比，具有良好的生物相容性、毒副作用小，是标记干细胞较理想的对比剂。由于USPIO最大直径不超过30 nm，更易通过组织的毛细血管壁均匀地分布于目标组织，且血浆半衰期更长，因此在研究中应用更广泛。但USPIO存在带负电、表面能高、缺少邻近的配位原子等缺点，直接注射靶向性极差，且标记浓度过高会引起细胞内的自由基生成增加，可以通过表面修饰增强其水溶性、生物相容性或靶向性，从而提高标记效率、降低毒性，达到对细胞实时成像、动态追踪的目的。目前使用较多转染的试剂主要包括脂质体转染剂和PLL、硫酸鱼精蛋白等阳离子物质转染剂，其原理都是依靠吸附作用使转染剂与对比剂结合形成复合物最终共同进入靶细胞。

有研究者进行Meta分析得到经PLL转染的SPIO用于分子影像学研究时最佳浓度区间为10～50μg·mL-1，故本实验中首先以此区间对hPMSCs进行标记。倒置显微镜下观察细胞形态发现当标记浓度≤25μg·mL-1时细胞形态与未标记细胞无明显差异，标记浓度为37.5μg·mL-1时部分细胞已有变形，标记浓度增加至50μg·mL-1时细胞大量死亡，考虑在干细胞的研究中实验对象均以骨髓间充质干细胞为主，来源不同的间充质干细胞生物学特性并不完全一致，hPMSCs较其他来源的MSCs对于磁性标记可能更敏感，且USPIO直径更小更容易进入细胞，因此在之后实验中将标记浓度区间调整为5～25μg·mL-1。普鲁士蓝染色可见在此区间USPIO浓度标记后细胞内均存在蓝染的铁颗粒，当标记浓度≥10μg·mL-1时标记率均大于95%，说明PLL-USPIO可高效标记hPMSCs。。但当浓度≥15μg·mL-1时背景较暗、细胞外残存铁较多，用于后续细胞活体示踪时应考虑是否会干扰观察影响结果判断。台盼兰染色及流式细胞术可客观反映转染后细胞的活性与凋亡情况，本实验中台盼蓝拒染率与细胞凋亡率均显示当标记浓度≥15μg·mL-1时细胞存活率和早期凋亡率与未标记细胞组差异有统计学意义，说明作为外来物质不论加入USPIO浓度大小，hPMSCs均会出现不同程度凋亡与坏死，当浓度>15μg·mL-1时对细胞产生的影响更明显，本实验发现USPIO的浓度对细胞早期凋亡率影响较大，而不同标记浓度的细胞晚期凋亡差异不明显。总凋亡情况主要取决于早期凋亡率的变化。CCK-8实验结果显示标记浓度在25μg·mL-1内对hP MSCs增殖能力无明显影响，随着时间和标记浓度增加毒性会逐渐增大、细胞增殖能力明显下降，因此应用于体内示踪时标记浓度及孵育时间都应控制在一定范围内。

综上，PLL-USPIO可以有效标记hPMSCs，USPIO最适浓度区间为5～15μg·mL-1，此时对hPMSCs的存活率、增殖能力及凋亡率等生物学特性均无明显影响，该结果可为进一步MRI活体示踪及临床应用提供实验依据。