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【研究内容】 观察脐带间充质干细胞对人体衰老的影响和安全性,对比观察脐带间充质干细胞对衰老的逆转现象。
【研究机构】 新乡医学院
【研究人员】 郭冰心
【发表时间及刊物】 2020年
【实验方法】 首先利用生物信息学Target Scan,miRanda数据库预测miR-340与TLR4基因3-'UTR序列结合的可能性,用双荧光素酶实验检测miR-340与TLR4的3-'UTR结合的能力,用RT-PCR和Western blot实验检测miR-340对TLR4表达水平的调控和下游信号通路p65磷酸化水平的调节。通过分化诱导对hUCMSCs成脂、成骨和成软骨鉴定,Umibio外泌体提取试剂盒提取干细胞外泌体并对表面标志物鉴定。然后构建过表达miR-340的hUCMSCs外泌体(MEX-miR-340)对构建的小鼠放射性肺损伤模型(IR)尾静脉分别注射PBS,MEX-miR-NC,MEX,MEX-miR-340,将IR小鼠分为四组:(Normal,IR+PBS,IR+MEX-miR-NC,MEX,IR+MEX-miR-340),ELISA检测各组小鼠血浆中炎症因子水平。Western blot检测各组小鼠辐射16周后各组肺组织样本中TLR4和NF-κB的磷酸化表达水平。HE染色,免疫组化染色等实验观察各组肺组织损伤减轻程度。观察各组小鼠20周存活率。结果双荧光素酶实验表明miR-340与TLR4的3-'UTR有结合能力,Western blot检测转染miR-340 mimic(50 nM)或mimic NC 48小时后RAW264.7细胞和293T细胞TLR4及其下游靶蛋白磷酸化水平(P-P65)均降低。
【结 果】 说明miR-340可以通过与TLR4的3'-UTR结合抑制TLR4的表达及其下游炎症通路。hUCMSCs具有成脂、成骨和成软骨潜能,流式细胞术分析hUCMSCs表面标志物其表面标志物CD29、CD73、CD90、CD105为阳性,CD14、CD19、CD45、CD34为阴性。透射电镜观察hUCMSCs外泌体的主要形态为圆形囊泡。Western blot检测外泌体表面标志为CD9,CD63。qRT-PCR检测MEX-miR-340中miR-340相对含量最高。ELISA检测显示血浆中炎症因子在MEX-miR-340+IR组中TNF-α,IL-1β,IL-6显著减少,而IL-10抗炎因子增加。Western blot检测小鼠辐射16周后肺组织样本表明,MEX-miR-340能明显降低TLR4和p65的磷酸化水平。HE,IHC staining表明MEX-miR-340+IR能明显减轻肺损伤。过表达miR-340的hUCMSCs外泌体治疗后辐射性肺损伤小鼠存活率显著提高。结论过表达miR-340的MSCs外泌体通过对TLR4的3'-UTR的结合抑制TLR4及其下游靶蛋白p65磷酸化水平表达。
【结 论】 与MEX相比,MEX-miR-340能更有效的缓解RILI炎症反应,提高抗炎能力,可作为一种安全有效的RILI的无细胞治疗策略。 |
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