【研究内容】

细菌内毒素定量检测方法的建立及应用评价

【研究人员】

段南

【发表时间及刊物】

2017年10月1日  

北京协和医学院硕士论文

【实验目的】

细菌内毒素是注射剂中的主要致热物质，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血。内毒素检测方法的灵敏性和准确性关系直接关系到检测结果可靠性，目前我们使用的是凝胶法检测，仅为限度判断，在疫苗质量检定上，可靠性和精准性是基本准则，因此建立细菌内毒素定量检测法很有必要。

【实验方法】

本研究根据2015版《中国药典》四部通则1143“细菌内毒素检查法”规定，对现有限度法检测得出的内毒素结果进行分析，同时拟建立动态浊度法进行定量检测，针对准确度、精密度、专属性、定量限、线性、范围和耐用性各项进行方法学验证。方法学验证完成后，进行各样品的适应性验证试验，并作出总结，对样品中可能存在的干扰及干扰的消除进行实验和分析，确定各个供试品的实际需要稀释倍数，做出应用评价。

【结 果】

结果动态浊度法建立，方法学验证结果如下：

1．准确度：各组数据回收率均值为100±30%，回收率符合50%～200%的要求；

2．精密度：取3个不同浓度内毒素，每个浓度平行测定3次，结果相同浓度的结果RSD不大于1，再采用同一份样品进行6次平行测定，RSD不大于0.85，符合重复性RSD不大于1的要求；

3．专属性：采用Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗单价原液，肠道病毒71型灭活疫苗原液、Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗、肠道病毒71型灭活疫苗和冻干甲型肝炎减毒活疫苗五个重要样品进行检测，可以不被杂质影响，准确检测出其中的细菌内毒素含量；

4．定量限：在标示灵敏度范围内，进行0.015EU/ml、0.020EU/ml和0.025EU/ml三个低浓度点的实验，测试结果回收率75~110%，回收率符合50~200%的要求，定量限可达0.015EU/ml；

5．线性(标准曲线可靠性)：4次实验，每次采用不同的稀释最低点浓度和不同的倍数，R2分别为：0.994、0.986、0.982和0.988，符合R2大于0.98的要求；

6．范围：在鲎试剂标示灵敏度0.015~10.0EU/ml范围内，回收率在90%～120%较窄范围之间，回收率符合要求；对鲎试剂标示灵敏度范围的±20%进行测定，结果显示，检测上限可适当延伸至12.0EU/ml，但下限不可延伸；

7．耐用性：选取不同蛋白含量和不同pH值，以及不同生产环节中间产品做比对。具体分别选取pH值为6.8、7.2和人为调节至8.5三个批次的EV71；蛋白质含量为2.3ug/剂、3.3 μg/剂和3.9 μg/剂的三个批次的sIPV；以及同批次纯化液和原液进行了测试；各组结果数据几乎无差异，符合结果不受影响的要求，耐用性良好。

8．系统的对各个疫苗需要检测内毒素的样品进行初步试验，结果如下：各样品的适应性试验，回收率均符合要求，说明该方法与我所产品的适应性良好，结果准确可靠；采取加大样品稀释倍数的方法，解决了牛血清这类容易出现阳性干扰的动物源样品的检测问题。

【结 论】

研究成功建立了细菌内毒素动态浊度定量检测方法，并按照药典《药品质量标准分析方法验证指导原则》进行了方法学验证，各指标验证结果均符合标准要求；运用该方法对我所各个制品进行的细菌内毒素检测，各样品的适应性良好，可以应用到日常检测。